31
阅读
0
评论
分享
基础研究
99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像评价阿托伐他汀干预后兔动脉斑块稳定性变化的可行性
中华核医学与分子影像杂志, 2017,37(07): 410-414. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2017.07.007
摘要
目的

探讨99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像评价阿托伐他汀干预后兔动脉斑块稳定性变化的可行性。

方法

将18只新西兰雄性大白兔按完全随机法分为稳定斑块组(A组)、易损斑块组(B组)、易损斑块他汀干预组(C组),均以高脂饲料喂养12周,2周时对A组行假手术,B组、C组行腹主动脉拉伤术,同时按体质量予以C组口服阿托伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1。各组分别在4、8、12周行99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像,计算T/NT比值。12周末处死实验动物,取腹主动脉行离体显像,以病理及免疫组织化学分析验证,计算各组MVD。组间比较采用单因素方差分析。

结果

4周时3组腹主动脉部位均未见明显放射性分布;8周时A、C组腹主动脉放射性摄取稍增高,B组腹主动脉中下段呈条形放射性摄取明显增高。12周时,3组腹主动脉放射性摄取均较8周时增加,以B组增量最为明显;T/NT比值分别为1.579±0.217、1.873±0.226、1.524±0.237(F=8.984,P<0.05)。12周末离体腹主动脉显像示病变部位放射性分布增高,B组明显高于A组、C组;HE病理染色结果示A组、C组动脉斑块分级为Ⅱ级,B组为Ⅳ级;3组MVD分别为8.17±1.17、15.86±1.07、7.17±1.60,差异有统计学意义(F=90.36,P<0.05)。

结论

99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像能够用于他汀类药物干预后兔动脉易损斑块的稳定性变化的效果评价,具有较高的灵敏度。

引用本文: 韩洁, 张颖, 王蒨, 等.  99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像评价阿托伐他汀干预后兔动脉斑块稳定性变化的可行性 [J]. 中华核医学与分子影像杂志,2017,37( 7 ): 410-414. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2017.07.007
正文
作者信息
基金  关键词  主题词
English Abstract
评论
阅读 31 引用 0
相关资源
视频 0 论文 0 大综述 0
以下内容和版式版权归属中华医学会,未经授权不得转载 ×

据统计,约70%的急性心脏事件是冠状动脉粥样硬化易损斑块的糜烂和破裂造成的[1],而与血管狭窄程度无直接关系[2]。他汀类药物能抑制炎性反应,减少血栓形成,稳定内皮功能和稳定斑块性质[3],早期应用能减少动脉粥样硬化心血管病的风险[4],降低死亡率[5]。目前临床用于评价动脉斑块的影像学方法大多是解剖学层面的,缺乏能评价斑块稳定性的方法[6]。本课题组前期研究[7]表明,99Tcm-3P4-RGD2可与斑块中的整合素αvβ3特异性结合,且易损斑块放射性摄取明显高于稳定斑块,能用于检测易损斑块。本研究通过观察他汀类药物干预后兔动脉斑块中的放射性摄取量,探讨99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像评价阿托伐他汀干预后兔动脉斑块稳定性变化的可行性。

材料与方法

1.设备与材料。显像设备为荷兰Philips Precedence 16 SPECT/CT仪,配备低能高分辨准直器;γ井型计数仪为美国Capintec公司产品。导管为美国爱德华公司Fogarty 120804 F型。99TcmO4-由北京森科医药有限公司提供,3P4-RGD2试剂盒购自北京仁杰国源科技有限公司。一抗为英国Abcam公司产品Ab9498,二抗为美国KPL公司产品074-1806, 3′3-二氨基联苯胺(3′3-diaminobenzidine,DAB)为丹麦Dako公司产品(K5007)。

2.实验动物与分组。新西兰雄性大白兔[许可证号:SCXK(京)2014-0012]18只,8周龄,体质量(2.5±0.3) kg,购自北京芳元缘养殖场。将兔按完全随机法分为稳定斑块组(A组)、易损斑块组(B组)、易损斑块他汀干预组(C组),均高脂饲料喂养12周。高脂饲料配方为:质量分数1%的胆固醇+质量分数5%的猪油+质量分数5%的蛋黄粉+质量分数89%的普通饲料。2周时A组动物行假手术,B组、C组行腹主动脉拉伤术,同时予C组口服阿托伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1[8]。第4、8和12周各组行99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像。在第12周末处死实验动物,取腹主动脉行离体显像,以病理HE染色及免疫组织化学分析验证。

3.动物模型制备。假手术:以质量分数3%戊巴比妥腹腔麻醉实验兔(按体质量1 ml/kg),无菌条件下,沿右股动脉走行纵向切开局部皮肤,钝性分离皮下组织及肌肉,游离右股动脉,缝合皮肤切口;术后肌内注射青霉素3 d(1.6×106 U/d)抗感染。

腹主动脉内膜拉伤术:同前方法麻醉实验动物并游离右股动脉,结扎股动脉远心端。于靠近远心端结扎处剪1斜行小口,插入球囊导管至腹主动脉,长度约20 cm,向球囊内注入生理盐水0.4 ml,使球囊膨胀至直径约0.5 cm,向下拖拉球囊导管至髂总动脉分叉处,重复操作3次,使内膜机械性损伤,撤出球囊,结扎股动脉,缝合切口。术后抗感染方法同前。

4. 99Tcm-3P4-RGD2分子探针标记。将925 MBq 99TcmO4-加入3P4-RGD2试剂盒中,充分混合均匀,沸水浴30 min,冷却至室温。经薄层色谱法测定,产品放化纯≥95%。

5. SPECT/CT显像。实验动物禁食禁水8 h后行腹腔基础麻醉,再经耳缘静脉注射99Tcm-3P4-RGD2 74 MBq,30 min后行SPECT/CT显像,兔取仰卧位,显像视野从耳根部至腹股沟区域。CT扫描参数:电压120 kV,电流150 mA,层厚0.5 cm,层间距0.5 cm。SPECT显像:探头旋转360°,以6°/帧采集,采集30 s,能峰140 keV,窗宽20%,矩阵128×128,放大倍数1.0。勾画ROI,测T/NT比值,共测3次,取平均值。靶区为腹主动脉斑块放射性摄取增高区,非靶区为腹部本底区。

6.离体腹主动脉显像。12周SPECT/CT显像结束后处死实验动物,取腹主动脉(自膈肌至髂动脉分叉处),观察管壁、管腔形态学特征,纵向剪开管壁,生理盐水冲洗干净,平铺展开,内膜面向上,观察内膜形态学特征,置于平行孔准直器下进行离体显像。

7.病理HE染色及免疫组织化学检测。以体积分数4%甲醛固定离体血管,石蜡包埋后连续切片,每隔5张取1张,用于HE染色及免疫组织化学检测。根据HE染色结果,选择斑块面积最大的切片做形态学分析。将动脉粥样病变参照AHA标准分为6型[9],Ⅰ型:内膜增厚;Ⅱ型:脂纹;Ⅲ型:过渡型斑块;Ⅳ型:具有完整内膜边界的粥样斑块;Ⅴ型:纤维粥样斑块或表明为新生纤维结缔组织覆盖的斑块;Ⅵ型:表面缺损、出血和(或)血栓的复杂斑块。

免疫组织化学检测:采用SABC法染色,显微镜观察参照Weidner法[10],先在100倍光学显微镜下选择切片MVD最高区域,再在200倍光学显微镜下选取5个视野,计数每个视野中新生微血管,求均值。

8.统计学处理。采用PASW 18.0软件,符合正态分布的计量资料采用±s表示,组间比较采用单因素方差分析,进一步的两两比较行最小显著差异法t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.造模结果。A组、B组实验动物均造模成功,每组6只均存活至12周。C组实验动物3周死亡1只,7周死亡1只,10周死亡1只,3只存活至12周。

2. 99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像结果。4周时,A、B、C组腹主动脉部位均未见明显放射性分布;8周时,A、C组腹主动脉中段及肾动脉开口水平放射性摄取稍增高,B组腹主动脉中下段呈条形放射性摄取增高,明显高于A组、C组;12周时,A、B、C 3组腹主动脉放射性摄取均较8周时增加,且以B组最为明显。A、C组肾动脉开口水平及腹主动脉中下段条形放射性摄取增高;B组腹主动脉各段均有放射性摄取增高,且下段放射性摄取浓聚(图1)。

图1
各组新西兰大白兔99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像结果(箭头示腹主动脉)。A. 4周时显像,稳定斑块(A)组、易损斑块(B)和易损斑块他汀干预(C)组腹主动脉部位均未见明显放射性分布;B. 8周时显像,A组腹主动脉中段及肾动脉开口水平放射性摄取稍增高,B组腹主动脉中下段呈条形放射性摄取增高,C组腹主动脉中段及肾动脉开口水平放射性摄取稍增高;C. 12周时显像,3组放射性摄取均较8周时增加
图1
各组新西兰大白兔99Tcm-3P4-RGD2 SPECT/CT显像结果(箭头示腹主动脉)。A. 4周时显像,稳定斑块(A)组、易损斑块(B)和易损斑块他汀干预(C)组腹主动脉部位均未见明显放射性分布;B. 8周时显像,A组腹主动脉中段及肾动脉开口水平放射性摄取稍增高,B组腹主动脉中下段呈条形放射性摄取增高,C组腹主动脉中段及肾动脉开口水平放射性摄取稍增高;C. 12周时显像,3组放射性摄取均较8周时增加

3组放射性摄取T/NT比值见表1。4周时3组间差异没有统计学意义(F=0.020,P>0.05)。8周时差异有统计学意义(F=5.829,P<0.05),A组与B组、B组与C组差异有统计学意义(t值:2.694、3.164,均P<0.05),A组与C组差异无统计学意义(t=0.177,P>0.05);12周时,3组差异也有统计学意义(F=8.984,P<0.05),A组与B组、B组与C组差异有统计学意义(t值:2.622、4.094,均P<0.05),A组与C组差异无统计学意义(t=0.501,P>0.05)。

表1

各组新西兰大白兔不同时间SPECT/CT显像的T/NT比值

表1

各组新西兰大白兔不同时间SPECT/CT显像的T/NT比值

组别不同显像时间的T/NT比值
4周8周12周
A组1.349±0.2851.407±0.1101.579±0.217
B组1.341±0.1751.601±0.0721.873±0.226
C组1.353±0.2071.419±0.1681.524±0.237
F0.020a5.829b8.984b

注:A组为稳定斑块组,B组为易损斑块组,C组为易损斑块他汀干预组;A,B组兔均为6只,C组4周时5只,8周时4只,12周时3只;符合正态分布的计量数据以±s表示;组间比较,aP>0.05, bP<0.05

3.离体腹主动脉显像结果。A组腹主动脉僵硬,管壁不规则,内膜见少量散在分布的白色颗粒状突起物,离体显像见相应部位放射性分布增高;B组腹主动脉僵直,管壁明显不规则,内膜明显增厚,累及腹主动脉全程,可见弥漫性白色突起,内夹杂点片状淡黄色突起,离体显像动脉呈条形不均匀放射性分布浓聚,淡黄色突起部位放射性分布最高;C组腹主动脉略僵硬,管壁不规则,内膜见条形分布的白色突起,离体腹主动脉显像见条形放射性分布增高(图2)。B组放射性分布明显高于A组、C组。

图2
各组新西兰大白兔腹主动脉大体解剖与显像图。A组为稳定斑块组,B组为易损斑块组,C组为易损斑块他汀干预组;各组上排为大体解剖图,下排为显像图
图2
各组新西兰大白兔腹主动脉大体解剖与显像图。A组为稳定斑块组,B组为易损斑块组,C组为易损斑块他汀干预组;各组上排为大体解剖图,下排为显像图

4.第12周末腹主动脉HE染色及免疫组织化学检测结果。病理检查示,3组腹主动脉内膜增厚,B组较明显;A组动脉斑块等级Ⅱ级,B组为Ⅳ级,C组为Ⅱ级(图3)。免疫组织化学检测结果(图4):A组内膜内见散在分布新生微血管,MVD为8.17±1.17;B组内膜内可见大量新生微血管,分布较密集,MVD为15.86±1.07;C组内膜处见散在分布新生微血管,MVD为7.17±1.60。3组MVD差异有统计学意义(F=90.36,P<0.05),A组与B组、B组与C组差异有统计学意义(t值:10.736、12.132,均P<0.05),A组与C组差异没有统计学意义(t=1.345,P>0.05)。

图3
各组新西兰大白兔腹主动脉HE染色结果(×100)。稳定斑块(A)组动脉内膜增厚,内皮细胞完整,斑块内可见多个脂质空泡,为脂纹,动脉斑块分级Ⅱ级;易损斑块(B)组动脉内膜明显增厚,管腔明显狭窄,动脉斑块呈粥样,可见多个较大的脂质核心,动脉斑块分级Ⅳ级;易损斑块他汀干预(C)组动脉内膜增厚,可见多个脂质空泡,为脂纹,动脉斑块分级Ⅱ级
图4
各组新西兰大白兔腹主动脉免疫组织化学检测结果(红箭头示新生微血管;SABC法×200)。A组内膜增厚,内见散在分布新生微血管;B组内膜明显增厚,管腔狭窄,内膜内可见大量新生微血管,分布较密集;C组内膜处见散在分布的新生微血管
图3
各组新西兰大白兔腹主动脉HE染色结果(×100)。稳定斑块(A)组动脉内膜增厚,内皮细胞完整,斑块内可见多个脂质空泡,为脂纹,动脉斑块分级Ⅱ级;易损斑块(B)组动脉内膜明显增厚,管腔明显狭窄,动脉斑块呈粥样,可见多个较大的脂质核心,动脉斑块分级Ⅳ级;易损斑块他汀干预(C)组动脉内膜增厚,可见多个脂质空泡,为脂纹,动脉斑块分级Ⅱ级
图4
各组新西兰大白兔腹主动脉免疫组织化学检测结果(红箭头示新生微血管;SABC法×200)。A组内膜增厚,内见散在分布新生微血管;B组内膜明显增厚,管腔狭窄,内膜内可见大量新生微血管,分布较密集;C组内膜处见散在分布的新生微血管
讨论

易损斑块的组织学特点已经明确[11],即斑块具有大量的脂质核心、较薄的纤维帽、新生微血管、点状钙化,炎性反应活动明显。冠状动脉斑块的常用影像学评价指标,如管腔狭窄程度、钙化积分等,不能准确判定斑块稳定性,在病变的精确判断和疗效评估方面存在局限性。对于他汀类药物干预后斑块性质的变化评价更是缺少有效的检测方法。

新生微血管的形成和炎性反应在易损斑块的形成过程中有重要作用,整合素αvβ3可由新生血管内皮细胞分泌,同时在激活的巨噬细胞表面表达水平也升高,可作为能同时反应动脉粥样病变中新生微血管和炎性反应的良好靶标[12]。本课题组前期研究[7]表明,99Tcm-3P4-RGD2能用于检测易损斑块。本研究中,B组腹主动脉放射性摄取明显高于A组,T/NT比值差异有统计学意义(P<0.05),也进一步证实了此点。

他汀类药物能抑制炎性反应,减少血栓形成,稳定内皮功能和斑块性质[3]。本研究中,C组斑块等级为Ⅱ级,B组斑块等级为Ⅳ级,表明经他汀干预后斑块易损程度明显降低。有研究[5]表明,他汀类药物能减少斑块中新生微血管的数量,稳定斑块性质。本研究中,C组MVD明显少于B组,与A组水平相当,证实了阿托伐他汀干预后斑块趋于稳定。

本研究中第12周SPECT/CT显像示C组腹主动脉99Tcm-3P4-RGD2的放射性摄取明显低于B组,与A组相当;C组与B组T/NT比值差异有统计学意义(P<0.05),而C组、A组差异无统计学意义(P>0.05)。在离体腹主动脉显像中,C组腹主动脉斑块处的放射性分布也明显低于B组,与A组相似。上述结果也说明他汀干预后的C组腹主动脉斑块较B组稳定,与A组的水平相当。这与病理HE染色及免疫组织化学的结果一致。因此,99Tcm-3P4-RGD2能用于评价阿托伐他汀干预后兔动脉易损斑块稳定性的变化。

研究[13]显示,采用高脂喂养加内膜拉伤的方法干预家兔,尤其是对外源性胆固醇吸收率高的新西兰大白兔,短期内便可形成高胆固醇血症,获得重复性较好的易损斑块动物模型。本研究中,A组的斑块等级为Ⅱ级,B组为Ⅳ级,与前期研究[7]相同,说明高脂喂养加内膜机械性损伤的新西兰大白兔可作为动脉易损斑块研究的良好动物模型。

本研究也存在局限性,C组实验动物死亡率较高,尸体解剖中发现其有严重脂肪肝,是否与他汀类药物的作用或药物剂量相关,有待进一步研究证实。另外,为保证药物干预的有效性,笔者在动脉斑块尚未形成时,就给予了大剂量的阿托伐他汀进行干预,与临床实践中治疗开始的时间点不一致,以后将进一步开展不同时间点开始药物干预及给予不同药物剂量的研究。

利益冲突

利益冲突 无

参考文献
[1]
谷珊珊米宏志王蒨. 99Tcm-Duramycin用于动脉易损斑块的检测[J].中华核医学与分子影像杂志2015, 35(1): 5358. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2015.01.013.
GuSS, MiHZ, WangQ, et al. Targeting vulnerable plaque of experimental atherosclerosis models with 99Tcm-Duramycin[J]. Chin J Nucl Med Mol Imaging, 2015, 35(1): 5358. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2015.01.013.
[2]
卢瞳文颂周官辉动脉粥样硬化斑块MRI和近红外分子影像的实验研究[J].中华核医学与分子影像杂志2012, 32(1): 1621.DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2012.01.006.
LuT, WenS, ZhouGH, et al. Molecular imaging of atherosclerosis in mice with MRI and near-infrared fluorescence imaging[J]. Chin J Nucl Med Mol Imaging, 2012, 32(1): 1621. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2012.01.006.
[3]
RondinaMT, MuhlesteinJB. Early initiation of statin therapy in acute coronary syndromes: a review of the evidence[J]. J Interv Cardiol, 2005, 18(1): 5563. DOI:10.1111/j.1540-8183.2005.04103.x.
[4]
StoneNJ, RobinsonJG, LichtensteinAH, et al. 2013 ACC/AHA guideline on the treatment of blood cholesterol to reduce atherosclerotic cardiovascular risk in adults: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J]. Circulation, 2014, 129(25Suppl 2): S145. DOI:10.1161/01.cir.0000437738.63853.7a.
[5]
AngeliF, ReboldiG, MazzottaG, et al. Statins in acute coronary syndrome: very early initiation and benefits[J]. Ther Adv Cardiovasc Dis, 2012, 6(4): 163174. DOI:10.1177/1753944712452463.
[6]
YooJS, LeeJ, JungJH, et al. SPECT/CT imaging of high-risk atherosclerotic plaques using integrin-binding RGD dimer peptides[J]. Sci Rep, 2015, 5: 11752. DOI:10.1038/srep11752.
[7]
苏航王蒨米宏志. 99Tcm-3PEG4-RGD用于家兔易损斑块分子显像[J].中国医学影像技术2014, 30(6): 813817.
SuH, WangQ, MiHZ, et al. 99Tcm-3PEG4-RGD for molecular imaging of vulnerable plaque in rabbits[J]. Chin J Med Imaging Technol, 2014, 30(6): 813817.
[8]
ZhaoQM, FengTT, ZhaoX, et al. Imaging of atherosclerotic aorta of rabbit model by detection of plaque inflammation with fluorine-18 fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography[J]. Chin Med J (Engl), 2011, 124(6): 911917. DOI:10.3760/cma.j.issn0366-6999.2011.06.020.
[9]
StaryHC, ChandlerAB, DinsmoreRE, et al. A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association[J]. Circulation, 1995, 92(5): 13551374.DOI:10.1161/01.CIR.92.5.1355.
[10]
WeidnerN, SempleJP, WelchWR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis—correlation in invasive breast carcinoma[J]. N Engl J Med, 1991, 324(1): 18. DOI:10.1056/NEJM199101033240101.
[11]
Silvestre-RoigC, de WintherMP, WeberC, et al. Atherosclerotic plaque destabilization: mechanisms, models, and therapeutic strategies[J]. Circ Res, 2014, 114(1): 214226. DOI:10.1161/CIRCRESAHA.114.302355.
[12]
韩洁王蒨动脉粥样斑块中巨噬细胞的分子影像学新进展[J].心肺血管病杂志2014, 33(6): 896898. DOI:10.3969/j.issn.1007-5062.2014.06.037.
HanJ, WangQ. Molecular imaging development of macrophage in atherosclerotic plaque[J]. J Cardiovasc Pul Dis, 201433(6):896898. DOI:10.3969/j.issn.1007-5062.2014.06.037.
[13]
DaughertyA. Mouse models of atherosclerosis[J]. Am J Med Sci, 2002, 323(1): 310. DOI:10.1097/00000441-200201000-00002.
 
 
关键词
主题词
动脉粥样硬化性
阿托伐他汀钙
体层摄影术,发射型计算机,单光子
体层摄影术,X线计算机
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸